膠體金制備注意事項及應(yīng)用

                                                            膠體金制備注意事項及應(yīng)用

                                                        圣賓儀器科技（上海）有限公司

一、膠體金的穩(wěn)定性及免疫膠體金的貯存

膠體金具有很高的動力學穩(wěn)定性，在穩(wěn)定因素不受破壞時自身凝聚極慢，可放置數(shù)年不發(fā)生凝聚。影響穩(wěn)定的因素主要有電解質(zhì)、溶膠濃度、溫度、非電解質(zhì)等。

金溶膠必須有少量電解質(zhì)作穩(wěn)定劑，但濃度不宜過高。高濃度親水性非電解質(zhì)能剝?nèi)ツz粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物質(zhì)促使溶膠凝聚，但一定量的高分子物質(zhì)反而可增加溶膠穩(wěn)定性，如蛋白質(zhì)、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的穩(wěn)定效果。

當金溶膠吸附蛋白質(zhì)后，溶膠的穩(wěn)定性隨溶液pH而變化，而這種變化又取決于吸附蛋白質(zhì)的等電點，如ConA，過氧化物酶等，當pH較低時保持穩(wěn)定，提高pH則顯得不穩(wěn)定，接近等電點或略高時又變得穩(wěn)定了。標記后的膠體金溶液可用0.2～0.5mg/ml PEG20000 作為穩(wěn)定劑。在4～10℃貯存數(shù)月有效，不宜冰凍。貯存中可能會發(fā)生程度不同的凝聚，可離心除去。

二、制備高質(zhì)量膠體金的注意事項

（1）玻璃器皿必須*清洗，最好是經(jīng)過硅化處理的玻璃器皿，或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性，不能獲得預(yù)期大小的金顆粒。

（2）試劑、水質(zhì)和環(huán)境：劑配制必須保持嚴格的純凈，所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制，或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜（0.45µm）過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。氯金酸極易吸潮，對金屬有強烈的腐蝕性，不能使用金屬藥匙，避免接觸天平稱盤。其１％水溶液在４℃可穩(wěn)定數(shù)月不變。實驗用水一般用雙蒸餾水。實驗室中的塵粒要盡量減少，否則實驗的結(jié)果將缺乏重復性。

金顆粒容易吸附于電極上使之堵塞，故不能用pH電極測定金溶液的pH值。為了使溶液pH值不發(fā)生改變，應(yīng)選用緩沖容量足夠大的緩沖系統(tǒng)，一般采用檸檬酸磷酸鹽(pH3～5.8)、Tris-HCL (pH5.8～8.3)和硼酸氫氧化鈉(pH8.5～10.3)等緩沖系統(tǒng)。但應(yīng)注意不應(yīng)使緩沖液濃度過高而使金溶膠自凝。

（3）配制膠體金溶液的pH以中性（pH7.2）較好。

（4）氯金酸的質(zhì)量要求上乘，雜質(zhì)少。最好是進口的。

（5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持數(shù)月穩(wěn)定，由于氯金酸易潮解，因此在配制時，最好將整個小包裝一次性溶解。

三、膠體金技術(shù)的應(yīng)用

1、免疫學中的應(yīng)用

（1）膠體金在電鏡水平的應(yīng)用

膠體金應(yīng)用電鏡水平的研究最早，發(fā)展最快，應(yīng)用*泛。其是可以通過應(yīng)用不同大小的顆?；蚪Y(jié)合酶標進行雙重或多重標記。直徑為3～15nm 膠體金均可用作電鏡水平的標記物。3～15nm 的膠體金多用于單一抗原顆粒的檢測，而直徑15nm 多用于檢測量較多的感染細胞。

膠體金用于電鏡水平的研究，主要包括：

① 細胞懸液或單層培養(yǎng)中細胞表面抗原的觀察。

② 單層培養(yǎng)中細胞內(nèi)抗原的檢測。

③ 組織抗原的檢測。

金標記在電鏡水平的應(yīng)用，主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫負染色、雙標記技術(shù)和原位雜交技術(shù)等。

實驗證明，該法樣本用量少、檢測速度快、對比明顯、操作簡單、敏感性和特異性高，既可用于抗原檢測，也可用于抗體檢測，因此，可同時適用于科研和診斷。

（2）膠體金在光鏡水平的應(yīng)用

膠體金同樣可用做光鏡水平的標記物，取代傳統(tǒng)的熒光素、酶等。各種細胞涂片、切片均可應(yīng)用。主要用于：

① 用單克窿抗體或抗血清檢測細胞懸液或培養(yǎng)的單層細胞的膜表面抗原。

② 檢測培養(yǎng)的單層細胞胞內(nèi)抗原，

③ 組織中或亞薄切片中抗原的檢測。

膠體金用于光鏡水平的研究，可以彌補其它標記物不可避免的本底過高和內(nèi)部酶活性干擾等缺點。

（3）膠體金在流式細胞儀中的應(yīng)用：

應(yīng)用熒光素標記的抗體，通過流式細胞儀計數(shù)分析細胞表面抗原，是免疫學研究中的重要技術(shù)之一。但由于不同熒光素的光譜相互重疊，區(qū)分不同的標記困難，因此必須尋找一種非熒光素標記物，用于流式細胞計數(shù)。這樣可以同時進行幾種標記。該標記物必須能夠改變散射角，膠體金可以明顯地改變紅激光散射角，因而可以作為流式細胞儀的標記物之一。

（4）凝集試驗：單分散的免疫金溶膠呈清澈透明的溶液，其顏色隨溶膠顆粒大小而變化，當與相應(yīng)抗原或抗體發(fā)生專一性反應(yīng)后出現(xiàn)凝聚，溶膠顆粒極度增大，光散射隨之發(fā)生變化，顆粒也會沉降，溶液的顏色變淡甚至變成無色，這一原理可定性或定量地應(yīng)用于免疫反應(yīng)。

（5）免疫印跡技術(shù)(immunoblotting)：免疫印跡是一種較新的免疫化學技術(shù)。用聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，得到的區(qū)帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，然后用酶免疫法（或免疫熒光、ＲＩＡ）進行定量。

免疫膠體金也可用于該法的定量。轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜與某特異性的抗體保溫后，再與經(jīng)葡萄球菌Ａ蛋白致敏的膠體金溫育，*洗去多余的膠體金，根據(jù)膜上膠體金顆粒顏色深淺可測知樣品中的特異性抗原。

利用金顆?？纱呋y離子還原成金屬銀這一原理，采用銀顯影劑增強金顆粒的可見性，更可大大提高測定靈敏度，檢測下限可低至 0.1ng，這種免疫金銀染色法應(yīng)用已日趨廣泛。

由于膠體金免疫印跡技術(shù)簡便、快速，且有相當?shù)母叩撵`敏度，在臨床免疫診斷上有很大的應(yīng)用潛力。

（6）膠體金在肉眼水平的應(yīng)用

膠體金取代傳統(tǒng)三大標記物，用于肉眼水平的免疫檢測中。除了膠體金本身具有的特點外，還有以下優(yōu)點：

①試劑和樣本用量極小，樣本量可低至1～2ul；

②不需γ－計數(shù)器、熒光顯微鏡、酶標檢測儀等貴重儀器，更適于現(xiàn)場應(yīng)用；

③沒有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質(zhì)參與；

④實驗結(jié)果可以長期保存；

⑤時間大大縮短，提高了檢測速度。

金標過程中，無共價鍵形成，是一定離子濃度下的物理吸附。因此幾乎所有的大分子物質(zhì)都可被金標記，標記后大分子物質(zhì)活性不發(fā)生改變。實驗結(jié)果表明，膠體金的敏感性可達到 ELISA的水平。而結(jié)合銀染色時，檢測的敏感性更大大提高。

2、免疫診斷技術(shù)中的應(yīng)用

膠體金標記技術(shù)由于標記物的制備簡便，方法敏感、特異，不需要使用放射性同位素，或有潛在致癌物質(zhì)的酶顯色底物，也不要熒光顯微鏡，它的應(yīng)用范圍廣，除應(yīng)用于光鏡或電鏡的免疫組化法外，更廣泛地應(yīng)用于各種液相免疫測定和固相免疫分析以及流式細胞術(shù)等。

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